Labmedya - Laboratuvar ve Sağlık Gazetesi

Petrol ve diğer fosil yakıtlara olan bağımlılığı azaltmanın bir yöntemi varsa o da tarımsal-endüstriyel atıkları biyoyakıtlar ve biyokimyasallar gibi toplumsal önemi olan moleküllere dönüştürmektir. Brezilya, dünyanın en büyük bitki biyokütlesi üreticilerinden biri olarak bu değişime liderlik etmek için iyi bir konumdadır. Öte yandan lignoselülozik ham maddelerin (linyin, hemiselüloz ve selüloz içeren) yapısını bozmak zordur veya (daha teknik olarak ifade edersek) mikrobiyal ve enzimatik bozulmaya karşı dirençlidirler.

Brezilyalı bilim insanları, içerdikleri şekerlerin kullanılabilirliğini artırarak bu malzemelerin depolimerizasyonunu nasıl iyileştireceklerine dair ipuçları bulabilmek için doğayı araştırıyorlar. Brezilya Enerji ve Malzeme Araştırma Merkezi'nin (CNPEM) bir kolu olan Brezilya Biyolojik Yenilenebilir Ulusal Laboratuvarı'ndaki (LNBR) bir araştırma ekibi, Campinas'ta (Sao Paulo eyaletinde bir şehir) omik (genomik, proteomik, metabolomik, vb.) ve senkrotron ışığını içeren disiplinler arası bir çalışma yürüttü. Ekip aynı zamanda kapibaraların bağırsağında mikroorganizmalar tarafından üretilen biyoteknolojik potansiyele sahip iki yeni enzim ailesi keşfetti.

Kapibaraların bağırsağında mikroorganizmalar tarafından üretilen biyoteknolojik potansiyele sahip iki yeni enzim ailesi keşfedildi. Hayvanın sindirim sisteminde bulunan mikroorganizmalar, bu biyokütleyi depolimerize etmek için benzersiz moleküler stratejilere sahip olabilirler. Kaynak: Gabriela Felix Persinoti.

Her iki enzim ailesi de bitki hücre duvarlarının bileşenleri üzerinde hareket edebiliyor ve bu nedenle biyoyakıtlar, biyokimyasallar ve biyomalzemeler üretmek için kullanılabilirler. Bunlardan biri, laktoz bozulmasını artırdığı için süt endüstrisinde de potansiyel uygulamalara sahip.

LNBR’nin Bilim Direktörü ve makalenin son yazarı Mario Tyago Murakami, “Araştırma hatlarımızdan biri, lignoselülozik atıkların yeniden kireçlenmesini azaltan yeni mikrobiyal mekanizmaların peşinde Brezilya çeşitliliğini araştırıyor. Kapibara'nın, inatçı bitki atıklarından enerji elde edebilen, oldukça adapte olmuş bir otobur olduğunu ve çok fazla çalışılmadığını belirtmiştik” dedi. 

Kapibara (Hydrochoerus hydrochaeris) dünyanın en büyük kemirgenidir ve bitkilerde bulunan şekerleri çok verimli bir şekilde enerjiye dönüştürür, ama bazı çevrelerde sevilmemesine rağmen nadir, fakat oldukça ölümcül bir bulaşıcı hastalık olan ve Rickettsia rickettsii bakterisinin neden olduğu Brezilya benekli ateşini ileten keneyi barındırabilir.

LNBR'de biyoinformatik araştırmacısı ve makalenin ilgili yazarı olan Gabriela Felix Persinoti, "Geviş getiren hayvanlar, özellikle büyükbaş hayvanlar hakkında çok sayıda çalışma bulunmaktadır, ancak tek mideli ot oburlar hakkında bilgi nispeten azdır. Ruminantlardan farklı olarak, kapibaralar, kalın bağırsağın başlangıç kısmı olan çekumda ot ve diğer bitki maddelerini sindirir. Yüksek verimli şeker dönüşümlerinin ışığında ve [São Paulo eyaletinin] Piracicaba bölgesindeki kapibaralar diğer bitkilerin yanı sıra şeker kamışı ile beslendikleri için, hayvanın sindirim sisteminde bulunan mikroorganizmaların bu biyokütleyi depolimerize etmek için benzersiz moleküler stratejilere sahip olabileceği hipotezinden yola çıktık. Bu da Brezilya endüstrisi için çok önemli" dedi.

Yeni metodoloji

Çalışmada kullanılan disiplinlerarası yaklaşım, multi-omikleri (kapibara bağırsak mikrobiyotasının moleküler yönlerini karakterize etmek için kullanılan genomik, transkriptomik ve metabolomik) ve biyoinformatik ile birlikte keşfedilen enzimleri atomik düzeyde analiz etmek için CNPEM'in parçacık hızlandırıcılarını içeriyordu. Murakami, "Senkrotron ışığının [bilim insanlarının malzemelerin iç yapılarını gözlemlemesine yardımcı olan son derece parlak bir elektromanyetik radyasyon kaynağı] kullanımı da dahil olmak üzere, tüm bu teknikleri birleştiren herhangi bir çalışmayı hatırlayamıyorum. Bu araştırmada analizimiz, mikrobiyal topluluklardan belirli proteinlerin atomik yapısına kadar tüm yolları deldi geçti" dedi.

Bilim insanları, kapibara popülasyonunu kontrol etmek için yerel politika kapsamında 2017 yılında Tatuí'de (São Paulo eyaleti) ötenazi uygulanan üç dişi kapibaranın çekum ve rektumundan toplanan örnekleri analiz ettiler. Hayvanlar ne hamileydi ne de R. rickettsii tarafından enfekte olmuşlardı.

Persinoti, "Çekal ve rektum örnekleri karın ameliyatı ile toplandı. Malzeme sıvı nitrojen içinde donduruldu. DNA ve RNA örnekleri laboratuvarda çıkarıldı ve bütünleştirici omikler kullanılarak büyük ölçekli dizilemeye gönderildi," dedi.

Tüm bakteri ve arkelerde (bir prokaryotik organizma takımı) bulunan işaretleyici genleri, bu durumda 16S'yi sıralayarak başladılar. Persinoti ayrıca, "Bu ilk sıralama ile çekum ve rektal numuneler arasındaki farklılıkları tespit edebildik ve içlerindeki ana mikroorganizmaları tanımlayabildik. 16S geni bize hangi mikroorganizmaların az ya da çok bulunduğuna dair yüzeysel bir cevap verdi, ancak mikroorganizmaların hangi enzimleri ürettiğini veya genomlarında hangi enzimlerin bulunduğunu söylemedi. Bu amaçla başka bir omik tekniği olan metagenomik kullandık. Kapibaraların mide-bağırsak yolundaki tüm mikrobiyal topluluktan DNA'yı büyük ölçekli dizilemeye gönderdik ve daha büyük miktarda veriler elde ettik. Bir dizi biyoinformatik aracı dağıtarak yalnızca numunelerin her birinde bulunan genomları ve her bir genomdaki genleri tanımlamayı değil, aynı zamanda hangi genlerin yeni olduğunu ve hangi mikroorganizmaların hiç tanımlanmadığını da bulmayı başardık. Bu şekilde, biyokütleyi depolimerize etme ve şekeri enerjiye dönüştürme potansiyeline sahip genlerin işlevlerini tahmin edebildik” açıklamasında bulundu.

Araştırmacılar ayrıca örneklerin toplandığı sırada hangi mikroorganizmaların en aktif olduğunu, başka bir deyişle mikroorganizmaların gerçekte hangi genleri ifade ettiğini bilmek istediler. Bu amaçla ham maddesi RNA olan metatranskriptomik kullandılar. Persinoti, "Kullandığımız başka bir teknik, mikroorganizmaların hangi metabolitleri ürettiğini doğrulamak için metabolomikti. Omik, biyoinformatik ve gerçek ve potansiyel gen ifadesinden elde edilen tüm bu bilgileri bir araya getirerek bitki liflerinin bu kadar yüksek verimli dönüşümünü sağlamada bağırsak mikroorganizmalarının rolünü deşifre edebildik. Süreçte hangi genlerin yer aldığını da bulabildik" dedi.

Araştırmacılar daha sonra tüm bu verileri analiz ederek bitki liflerinin yeniden kireçlenmesini azaltmada önemli bir rol oynayabilecek genleri tanımladılar ve esas olarak şimdiye kadar bilinmeyen hedeflere odaklandılar. Persinoti, "Seçim stratejisi, bitki biyokütle depolimerizasyonunda yer alan bol miktarda gen içeren yeni genomlara odaklandı. Bu genlerin mikroorganizmaların genomlarında nasıl organize edildiğini gördük ve bu bilgiyi inatçı bitki liflerinin parçalanmasında rol oynayabilecek bilinmeyen işlevleri olan yakın genlerin olup olmadığını bulmak için kullandık. Bu önemlidir, çünkü yeni genlerin araştırılmasına rehberlik eder, ama bu sonuçları ancak daha sonraki bir aşamada deneysel olarak gösterebildiğimiz zaman, bu yeni enzim ailelerinin oluşumunu kurabiliriz” dedi.

Bu adayları belirledikten sonra, araştırmacılar, işlevlerinin biyokimyasal gösterimine geçtiler. Persinoti, "Genleri in vitro sentezledik ve karşılık gelen proteinleri üretmek için bir bakteri kullanarak ifade ettik. Bu proteinlerin işlevlerini ve nerede hareket ettiklerini keşfetmek için birkaç enzim ve biyokimyasal tahlil yaptık. Senkrotron ışığı ve diğer teknikleri kullanarak proteinlerin atomik yapılarını belirledik. Bu işlevsel ve yapısal bilgilerle proteinlerin hangi bölgelerinin aktiviteleri için kritik olduğunu bulmak ve işlevlerinin altında yatan moleküler mekanizmaları analiz etmek için başka deneyler yapabildik” açıklamasında bulundu.

Murakami'ye göre, ikili doğrulama, yeni ailelerin gerçekten dahil olmasını sağladı. Murakami, "Yeni keşfedilen bir ailenin evrenini teorik olarak oluşturan diziler setinde daha önce incelemiş olduğumuza pek benzemeyen bir gen seçtik. Geni sentezledik, saflaştırdık, biyokimyasal olarak karakterize ettik ve dizinin öncekiyle aynı işlevsel özelliklere sahip olduğunu gösterdik. Başka bir deyişle bu proteinlerin gerçekten yeni bir aile oluşturduklarından kesinlikle emin olmak için yeni ailenin ikinci bir üyesini karakterize ettik" dedi.

Yeni enzimler ve kokteyller

Persinoti'ye göre, yeni bulunan ailelerden biri olan GH173, gıda sektöründe potansiyel kullanımlara sahipken; bir diğeri CBM89, karbonhidrat tanıma ile ilgilidir ve şeker kamışı küspesi ve samandan ikinci nesil etanol üretimine yardımcı olabilir.

Araştırmacılar ayrıca aşırı enzim üreten mantarlarla enzim kokteylleri geliştiriyorlar ve yeni keşfedilen enzimler doğal olarak bu mantar platformlarına dahil edilebilirler. Murakami, "Yeni enzim ailelerinin keşfi, yeniliği desteklemek için teknoloji transferi ile entegre edilebilir. Grubumuzda, özellikle karanlık genomik madde dediğimiz şeyi - bilinmeyen potansiyele sahip bu karmaşık mikrobiyal toplulukların parçalarını - anlamak için bu büyük Brezilya biyoçeşitlilik hazinesini keşfetmekle çok ilgileniyoruz” dedi.

Makale: “Gut microbiome of the largest living rodent harbors unprecedented enzymatic systems to degrade plant polysaccharides” 

DOI: 10.1038/s41467-022-28310-y