Labmedya - Laboratuvar ve Sağlık Gazetesi

info endüstri
labmarker banner

HPLC Kromatografisi

Yazı dizimizin ilk kısmında HPLC nin tanımıyla ilgili bilgi vermiştik, ama ben yine de kısaca açıklayayım; HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi kısaca HPLC olarak adlandırılır.
HPLC Kromatografisi
02 Aralık 2015, Çarşamba

 Yüksek performans; yüksek resolüsyonu (ayrımı) ifade eder. Mobil fazın yüksek basınçla ilerlemesi sağlandığı için de Yüksek basınçlı Sıvı Kromatografi olarak da adlandırılır.

Mobil Faz :

Analiti taşıyan ( Analiz ettiğimiz maddeler ) hareketli fazdır, Mobil faz genellikle su ve sulu tampon çözeltiler, bunların metanol ve/veya asetonitril ile oluşturulan çözeltileri veya organik solvanlardan oluşur. Mobil fazın bileşimi ve pH değeri ayırmı direk etkiler, kullanılan tekniğe, numune tipi ve  kolona göre mobil faz seçilmelidir.
 

Degazör :

Mobil faz şişesinden taşınan hareketli fazdaki hava kabarcıklarının ve çözünmüş havanın giderilmesini sağlar, kullanılan mobil faz adedi ve pompa tiplerine göre uygun degazörler bulunmaktadır.
 

Pompa :

Temel olarak pompa mobil fazın yüksek basınçla HPLC sistemi içinde hareket etmesini sağlar, degazörden mobil fazı çekip, örnekleme ve kolon ünitesine gönderir, bu işlemi akış hızını ve basınç değerini ayarlayarak gerçekleştirir. Akış hızı aralıklarına göre pompalar Analitik, Analitik-Preparatif ve Preparatif olarak gruplandırılabilir. Analitik pompalar genellikle 0.1 – 5ml akış değerleri arasında kullanılır. Mobil faz adedi ve karıştırma kabiliyetlerine görede İzokratik (Tek Kanallı) , Binary Gradient ( Çift Kanallı Mikserli ) ve Queternary Gradient ( Dört Kanallı Mikserli-Miksersiz ) olarak dizayn edilir. Bazı üreticiler ( Örnek : LabAlliance ) isteğe bağlı olarak Sekiz kanala kadar kullanıcıya özel dizayn yapabilmektedir. İzokratik çalışmalarda mobil faz önceden karıştırılıp hazırlanır, Gradient çalışmalarda karışım değişik zamanlarda değişik oranlarda yapılabilir. Bu sayede analiz kalitesi arttırılıp, analiz süreleri azaltılabilir. Pompa ünitesi genellikle iki pistonlu başlık, basınç dengeleyici ( damper ), işlemci, ınlet ve outlet check valflerden oluşur. Günümüzde Nano ve Ultra Basınçlı pompaların kullanılmaya başlamasıyla, HPLC sistemleri UHPLC ve nHPLC gibi isimlendirilmektedir. Uzun süreli kullanım ve tekrarlanabilir sonuçlar için pompa temizliği ve bakımına dikkat edilmelidir.
 

Örnekleyici :

Örnekleyici Analitlerin ( Numunelerin ) kolon ve detektöre gönderilmesini sağlar. Örnekleyici temel olarak iki tiptedir; Manuel ( El tipi ) ve Otoörnekleyici ( Otomatik ) modeller. Manuel örnekleyicilerde numune bir şırıngaya çekilip valf yardımıyla sisteme gönderilir. Otoörnekleyicilerde ise bu işlemleri cihaz kendisi yapabilmektedir. Bazı ünitelerde soğutma, ısıtma, seyreltme ve karıştırma özellikleri vardır. 10 vialden 1000 viale kadar değişik kapsitede olanları bulunabilir. Otoörnekleyiciye numune verirken en önemli konu numunenin temiz olmasıdır, aksi halde sistme çabuk kirlenir veya tıkanır. Numuneleri cihaza göndermeden önce muhakkak şırınga filtresinden veya kartuştan geçirmek gerekir, numunenin mümkün olduğunca berrak ve renksiz olmasını tercih ederiz. Şırınga filtresi, kartuş ve numune vialleri seçimi ve kullanım alanları için www.labhut.com sitesinden daha fazla bilgi alabilirsiniz.
 

Kolon- Kolon Fırını :

Kolon ( Sabit Faz ) maddelerin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden yararlanarak birbirlerinden ayırt edilmesini sağlar. Genellikle Çelik, PEEK ve Camdan imal edilir, içi belli ölçülerde sabit fazla doldurulur ( Silika veya polimer gibi ). Kolon Fırını kolonu saklamak ve sabit sıcaklıkta tutmak için kullanılır. Blok ısıtıcılı, Fanlı ve Peltier kolon fırınları mevcuttur. Peltier sistemler çok çabuk ısıtılıp soğutulabildiği ve daha stabil sıcaklık sağladığı için tercih edilir. Kaçak sensörlü ve multi kolon teknolojili olanları da mevcuttur. 
 
 
Kolonlar genellikle fonksiyonel grup eklenmiş silika veya polimer bazlı dolguludur. HPLC nin hayata geçmesiyle kullanılmaya başlanan silika bazlı kolonlar artık yerini yavaş yavaş hızlı analiz yapabilen mikro ve nano gözenekli polimer bazlı kolonlara bıramaya başlamıştır. Polimer kolonlar silika bazlı olanlara göre ortalama 3 kat daha uzun ömürlüdür ve rejenere edilebilir. Kullanılan mobil faz, sabit faz ( kolon ) ve moleküler etkileşim türlerine göre HPLC teknikleri aşağıdaki temel gruplarda toplanabilirler;
 
 
Normal faz kromatografi: 
Sabit faz polar (Silikajel-Polimer ve üzerine bağlanmış –CN, -NO2 veya NH2 dolgu maddeleri)
Mobilfaz non-polar yada düşük polariteye sahip( Etileter, Kloroform, Hekzan vb. çözücüler ve karışımları)
Düşük polariteye sahip analit kolondan ilk çıkar. Benzer özelliklere sahip maddelerin birbiri içinde dağılma özelliği yüksek olduğu için  düşük polariteye sahip analit mobil fazda çok iyi çözünür ve kolondan ilk önce çıkar. Ayrıca yine aynı özellik sebebiyle apolar analit polar sabit fazla az etkileştiğinden dolayı kolonda kısa süre tutunabilir.
Alıkonma zamanını kısaltmak için mobil fazın polaritesi azaltılır. Alıkonma zamanını arttırmak için mobil fazın polaritesi artırılır. 
 
Ters faz kromatografi:      
  • Sabit faz apolar  ( Silikajel-Polimer ve üzerine bağlanmış C18, oktil veya fenil grupları, metil, etil ve –NH2 gruplu dolgu maddeleri)
  • Mobilfaz polar (Metanol, Asetonitril, Tetrahidrofuran gibi güçlü organik çözücülerin zayıf çözücü olan sulu veya tamponlanmış, pH ayarı yapılmış karışımları)
  • Yüksek polariteye sahip analit kolondan ilk çıkar. Benzer özelliklere sahip maddelerin birbiri içinde dağılma özelliği olduğu için yüksek polariteye sahip analit mobilfazda çok iyi çözünür ve kolondan ilk önce çıkar. Ayrıca yine aynı özellik sebebiyle polar analit apolar sabit fazla az etkileştiğinden dolayı kolonda kısa süre tutunabilir.
  • Alıkonma zamanını kısaltmak için mobil fazın polaritesi azaltılır. Alıkonma zamanını arttırmak için mobil fazın polaritesi artırılır. 
Normal Faz Kromatografide düşük polariteye sahip mobil fazda alıkonma zamanları uzun,  polaritesi arttırılmış mobil fazda alıkonma zamanları kısadır. 
Ters Faz Kromatografide yüksek polariteye sahip mobil fazda alıkonma zamanları uzun,  polaritesi azaltılmış mobil fazda alıkonma zamanları kısadır. 
 
İyon Değiştirme:  
  • İyonik bileşikleri ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Ayrıca suda çözünen organik maddelerin analizinde de kullanışlıdır.
  • Katyonlar için negatif yüklü fonksiyonel gruplu dolgu maddeli kolonlar, Anyonlar için pozitif yüklü fonksiyonel gruplu dolgu maddeli kolonlar kullanılır.
  •  İyonun molekül ağırlığı arttıkca kolonda tutunma gücü de artar.
Size Exclusion (Eleme):  
  • Molekül ağırlıkları farkı çok büyük olan analitlerin bir arada analiz leneceği karışımlar için kullanılan bir tekniktir.
  • Bu teknikte analitler ve kolon dolgu maddesinde kimyasal değil fiziksel bir etkileşim vardır. Büyük molekül ağırlığı olan analit kolon dolgu maddesindeki porlara sığmadığı için kolonu önce terk eder. 
  • Genellikle polimer, şeker ve protein analizlerinde kullanılır.
  • Eleme tekniğinde kullanılan mobilfaz organik çözücü ise GPC (Gel Permeation Chromatography) , sulu çözelti ise GFC (Gel Filtration Chromatography) adını alır.
Chiral Ayırma:  
  • Fiziksel özellikleri aynı olan izomerlerin sabit fazla etkileşime girip izomer çifti olan diastereomere dönüştürülerek özel chiral kolonlar kullanılarak yapılan bir tekniktir.

 

 H. Cem UZUNER

Kimyager

Etiketler#hplc#kromatografisi
Toplam Görüntülenme 10864
methrom detay sayfa alt
  • sol alt BIOEXPO
 
3WTURK CMS v8.3.1